Биохимия старения

Информационная РНК (мРНК) гистона Н5 не содержит полиадениловой кислоты на 3'-конце, как это имеет место в случае других гистонов. У птиц на ранних стадиях развития клеток эритроидного ряда содержится мало гистона Н5. По мере развития этих клеток его количество увеличивается и, как следствие, уменьшается транскрипционная активность хроматина, хотя содержание РНК — нуклеотидилтрансферазы не меняется. В неделящихся зрелых эритроцитах синтез гистона Н5 продолжается даже тогда, когда другие пять гистонов уже не синтезируются [336]. Если гистон Н5 удалить из хроматина, то подавление транскрипционной активности ослабляется. Его синтез не координирован с синтезом других гистонов и не синхронизирован с синтезом ДНК: он синтезируется после других гистонов. Поскольку на ранних стадиях развития эритроцитов гистон Н5 отсутствует и появляется только на стадии эритробласта, когда он постепенно накапливается и подавляет при этом транскрипционную активность, было высказано предположение, что подавление происходит в результате конденсации хроматина, ведущей к его инактивации. Если ввести гистон Н5 не в эритроциты, а в другие клетки, то транскрипция также подавляется. Другое важное обстоятельство заключается в том, что вновь синтезированный гистон Н5 в развивающихся клетках эритроидного ряда фосфорилирован, а впоследствии, в ходе созревания клеток и ослабления транскрипции, дефосфорилируется. Таким образом, гистон Н5 играет, по-видимому, важную роль в поддержании сильно репрессированного состояния хроматина в имеющих ядра эритроцитах [35, 49, 168, 336]. Интересно отметить, что экспрессия гена гистона Н5 происходит только в клетках эритроидного ряда на специфической стадии, но как начинается его экспрессия и как она запрограммирована — неизвестно.

Протамины

Протамины представляют собой основные белки с малой молекулярной массой; они присутствуют в хроматине спермы вместо гистонов. Протамины появляются на стадии сперматиды и заменяют гистоны хроматина. Для них характерен полиморфизм. В сперме форели содержатся протамины трех типов, состоящие из 31–33 аминокислот. Протамины спермы млекопитающих длиннее — в их цепях ~45 аминокислот. Они богаты аргинином и не содержат лизина и триптофана; аргинин составляет две трети всех аминокислот. Собирающиеся в кластеры аргининовые остатки образуют длинные участки, с помощью которых протамины связываются с ДНК сперматид. После образования этой связи транскрипционная активность хроматина полностью подавляется. Если удалить протамины, то хроматин принимает вид бусинок и становится чувствительным к микрококковой нуклеазе. При добавлении протаминов эта структура исчезает и хроматин становится невосприимчивым к нуклеазе. Сериновые остатки протаминов могут быть фосфорилированы и дефосфорилированы. Полагают, что эта ковалентная модификация необходима для правильного связывания протаминов с ДНК [105], Ниже показана структура типичного протамина рыб:

Протамины, как и гистоны, синтезируются в цитоплазме. Их короткие мРНК транслируются на дирибосомах. Эти РНК в отличие от мРНК гистонов содержат на 3'-конце полиадениловую кислоту [169]. На 5'-конце они имеют 7-метилгуанин. Хотя в семенниках форели протамины синтезируются на стадии сперматиды, транскрипция их мРНК происходит значительно раньше, а именно на стадии первичного сперматоцита [170]. мРНК так же, как и рибонуклеопротеидные частицы, до наступления стадии сперматиды остается неактивной. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае гистонов. Ооциты Xenopus содержат мРНК материнских гистонов в неактивной форме, которые активируются и транслируются во время деления яйца. Протамины содержатся только в сперматоцитах, однако неизвестно, почему экспрессия их генов происходит только в этих клетках и как она начинается на соответствующей стадии развития этих клеток.

Гены гистонов

Гистоны синтезируются в S-фазе клеточного цикла. Это обстоятельство помогло выделить мРНК гистонов из быстро делящихся эмбрионов для идентификации и локализации генов гистонов путем молекулярной гибридизации и клонирования [39, 51, 187, 373]. На ранней стадии дробления эмбриона морского ежа гистоны составляют 25–30 % вновь синтезируемых белков, а мРНК гистонов — почти 70 % всех мРНК. Кроме того, мРНК гистонов гибридизуются с ДНК в несколько сотен раз быстрее, чем многие другие мРНК. Это указывает на наличие большого числа копий генов гистонов. При исследовании шести видов морских ежей было показано, что гены гистонов повторяются в гаплоидном геноме 300-1000 раз. У Drosophila, Xenopus, человека и цыплят повторяемость составляет 100, 10–20, 10–20 и 10 раз соответственно. Такие большие различия в количестве этих генов могут быть связаны с тем, что гистоны необходимы на ранней стадии дробления. Яйца Xenopus содержат большое количество материнских гистонов, тогда как в яйцах морского ежа их очень мало. По-видимому, в первом случае у клеток нет необходимости синтезировать на ранней стадии быстрого деления большое число гистонов. Во втором случае нужно быстро синтезировать гистоны, чтобы не отставать от темпа быстрого деления клеток, и большое количество генов способствует этому.

В исследованиях на Drosophila показано, что гены гистонов расположены в хромосоме II. Пять структурных генов пяти гистонов богаты парами G-C и тандемно повторяются. Они разделены участками, богатыми парами А-Т, которые не транслируются. Вся область кодирования генов гистона содержит 6000–7000 пар оснований ДНК. Ниже показаны расположение и длина генов в яйце морского ежа вместе со спейсерными участками (S) [39].

Структурные гены гистонов не содержат интронов, или нетранслируемых областей, как гены глобина, яичного альбумина и иммуноглобулина, а также не транскрибируются как более длинные предшественники РНК [312]. Спейсерные области не имеют небольших повторяющихся последовательностей оснований, как это наблюдается у генов рРНК и 5S-PHK. У всех видов морских ежей порядок расположения и направления транскрипции гистоновых генов одинаковы, тогда как у разных видов Drosophila они различны [230]:

Синтез и обновление гистонов

Гены гистонов транскрибируются в направлении 5'->3' с помощью РНК-полимеразы II, так как процесс транскрипции чувствителен к -аманитину [225]. По-видимому, мРНК пяти гистонов транскрибируются отдельно, а не как единая полицистронная мРНК [205]. Они имеют коэффициент седиментации приблизительно 9S и могут быть разделены в полиакриламидном геле [187]. На 3'-конце мРНК гистонов нет полиадениловой кислоты [5], а на их 5'-конце присутствуют последовательности m⁷G(5')pppN^m или m⁷G(5')pppN^mpN [260].

Синтез гистонов тесно связан с синтезом ДНК. мРНК гистонов синтезируются в начале S-фазы, а затем переходят в цитоплазму, где они соединяются с рибосомами для синтеза гистонов [293, 303, 310, 331]. мРНК гистонов существуют приблизительно столько же времени, сколько длится S-период, т. е. 10–12 ч. Есть сообщение, что для транскрипции мРНК гистонов необходимы фосфорилированные НГБ [194], но оно требует подтверждения.

Если синтез ДНК затормозить с помощью цитозинарабинозида или оксимочевины, то синтез мРНК гистонов также прекращается, уже образовавшиеся мРНК разрушаются и синтез гистонов останавливается. Как только это происходит, прекращается также синтез ДНК [188, 366, 379]. Таким образом, клетка обладает механизмом, "включающим" и "выключающим" гены гистонов в соответствии с синтезом ДНК. Стехиометрическое соотношение синтезированных гистонов Н1:Н2А:Н2В:Н3:Н4 равно 0,5:1:1:1:1. Это свидетельствует о том, что четыре гена нуклеосомных гистонов транскрипционно связаны, и их трансскрипция, вероятно, скоординирована. По-видимому, матрица для гистона Н1 не связана с другими генами, поскольку количество синтезированного гистона Н1 составляет только половину количества других гистонов. У Drosophila, расположение гистоновых генов у которой отличается от расположения генов у морского ежа, ген гистона Н1 отделен от гена гистона Н3 1200 парами оснований ДНК. Следовательно, он может иметь самостоятельный промотор [230]. Более того, синтез гистона Н1 в фазе G₁ в три раза интенсивнее синтеза других гистонов [343].

Известно несколько исключений из общего правила сопряжения синтеза гистонов с синтезом ДНК. Например, у лягушки Xenopus laevis при эмбриогенезе не наблюдается упомянутой синхронности на ранних стадиях дробления [3]. В зародышах Vicia faba гистоны появляются в фазах G₁ и S [123]. На ранних стадиях эмбриогенеза морского ежа синтез гистонов начинается в фазе G₁ и продолжается до фазы G₂. Однако в начале дифференцировки их синтез становится синхронным с синтезом ДНК [17]. Обусловлена ли эта синхронизация каким-либо фактором, появляющимся на стадии дифференцировки, неизвестно. В клетках HeLa мРНК гистонов транскрибируется в течение всего клеточного цикла, но их трансляция происходит только в S-фазе [250]. Таким образом, в клетках HeLa с синтезом ДНК координирована трансляция, а не транскрипция. Очевидно, синтез гистонов регулируется на двух этапах — трансляции и транскрипции — с помощью двух разных сигналов. Поскольку молекулы мРНК гистонов малы, их трансляция происходит на дирибосомах. После синтеза гистоны переходят из цитоплазмы в ядро [366].

Судьба четырех нуклеосомных гистонов в процессе деления клетки изучалась с помощью ³Н-лизина и других меченых аминокислот [220]. На примере культуры in vitro миобластов цыпленка показано, что, когда клетка делится, уже существовавшие нуклеосомные гистоны остаются в одной из дочерних клеток, а вновь синтезированные гистоны переходят в другую клетку. Таким образом, новые гистоны, по-видимому, не смешиваются со старыми, и какое-то время их состав сохраняется неизменным. Последовательно синтезирующиеся нуклеосомы располагаются в основном рядом друг с другом. Более того, гистоны в них существуют в неизменном виде в течение трех-четырех поколений. Каким образом это достигается, неизвестно. По-видимому, существует механизм, с помощью которого дифференцированное состояние материнской клетки может передаваться дочерним. В работе с использованием ³Н-аргинина и ¹²⁵I-иоддезоксиуридина в культуральной среде, содержащей клетки мыши [153], было показано, что нуклеосомные гистоны сохраняются в течение многих поколений. Этот факт очень важен, так как ново-синтезированные гистоны связаны с новообразованной ДНК [353]. Высказано предположение, что некоторые НГБ также сохраняются в процессе деления клетки [122]. Такая консервация нуклеосом и НГБ вместе с последующей транскрипционной специфичностью может служить тем механизмом, с помощью которого достигается и сохраняется дифференцировка клетки. Гистон Н1, однако, в течение одного клеточного поколения обновляется на 15 % [141]. Кроме того, он интенсивно фосфорилируется в конце фазы G₂ клеточного цикла, что совпадает по времени с конденсацией хромосомы [48]. Быть может, фосфорилирование является пусковым механизмом митоза.

Структура хроматина

Химический состав хроматина был установлен несколько лет назад. Однако функции его составных частей, способ их организации, механизм конденсации хроматина во время митоза и последующего разрыхления, способ, с помощью которого происходит экспрессия определенных генов в клетках какого-либо типа и репрессия в других, механизм экспрессии генов в определенные периоды жизни и их репрессии в другое время стали проясняться лишь недавно. Для того чтобы понять механизм экспрессии генов и способы его регулирования, необходимо знать структуру и организацию хроматина.

Тщательные биохимические и биофизические исследования с использованием электронной микроскопии, начатые в 1973 г., позволили установить структуру и функции хроматина. Когда хроматин тимуса теленка гидролизовали ДНКазой, появлялись частицы размером 200 пар оснований или кратным ему [157]. Это свидетельствует о том, что хроматин имеет повторяющиеся участки. Олинс и Олинс [272] выдерживали интерфазные ядра тимуса и печени крысы и эритроциты цыпленка в гипотонической среде и изучали их под электронным микроскопом после соответствующего окрашивания. Хроматин выглядел как цепочка бусинок диаметром 7 нм, связанных друг с другом тяжами ДНК диаметром 1,5 нм (рис. 2.2). Одновременно было показано [163], что при расщеплении хроматина микрококковой или стафилококковой нуклеазами, которые разрывают обе цепи ДНК, образуются частицы диаметром 7 нм, содержащие 200 пар оснований. В работе с использованием биохимических методов и дифракции рентгеновских лучей [200] также установлено, что частицы, получаемые в процессе расщепления нуклеазой, содержат 200 пар оснований ДНК; это составляет почти 85 % общего содержания ДНК в хроматине. Каждая из этих частиц содержит по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, образующих октамер. Таким образом, эти частицы, позднее названные нуклеосомами [139], содержат восемь молекул гистонов и 200 пар оснований ДНК. Показано также [139], что при соединении гистонов четырех типов и ДНК появляются частицы, похожие на те, которые образуются из хроматина после расщепления нуклеазой. Гросс-Беллард и Шамбон ([139] высказали предположение, что центральную роль в формировании нуклеосомы играют богатые аргинином гистоны Н3 и Н4. Гистон Н1 отсутствует в этих частицах, он расположен между нуклеосомами.