Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

1. Клетки, иммобилизованные в или на инертном субстрате, образуют биомассу гораздо медленнее, чем растущие в жидких суспензионных культурах.

Какова же связь между ростом и метаболизмом? При чем здесь клеточная организация и дифференцировка? Предполагают, что эта взаимосвязь обусловлена двумя типами механизмов. Первый механизм основан на том, что рост определяет степень агрегации клеток, оказывая косвенное влияние на синтез вторичных метаболитов. Организация в данном случае является результатом агрегации клеток, а достаточная степень агрегации может быть получена только в медленно растущих культурах. Второй механизм связан с кинетикой скорости роста и предполагает, что «первичный» и «вторичный» пути метаболизма по-разному конкурируют за предшественники в быстро и медленно растущих клетках. Если условия среды благоприятны для быстрого роста, то в первую очередь синтезируются первичные метаболиты. Если быстрый рост блокирован, то начинается синтез вторичных метаболитов. Таким образом, низкая скорость роста иммобилизованных клеток способствует высокому выходу метаболитов.

2. Кроме медленного роста иммобилизация клеток позволяет им расти в тесном физическом контакте друг другом, что благоприятно отражается и на химических контактах.

В растении любая клетка окружена другими клетками, но ее положение меняется в ходе онтогенеза в результате деления как этой, так и окружающих клеток. От положения клетки в растении зависит степень и тип дифференциации этой клетки. Следовательно, физическое окружение клетки влияет на ее метаболизм. Каким образом? Регуляция синтеза вторичных метаболитов находится как под генетическим, так и под эпигенетическим (внеядерным) контролем, то есть любые изменения в цитоплазме могут привести к количественным и качественным изменениям в образовании вторичных метаболитов. В свою очередь, цитоплазма представляет собой динамическую систему, находящуюся под влиянием окружающей среды.

Из внешних условий на метаболизм существенное влияние оказывают 2 важных фактора: концентрация кислорода и углекислого газа, а также уровень освещения. Свет играет роль и в процессе фотосинтеза, и в таких физиологических процессах, как деление клеток, ориентация микрофибрилл, активация ферментов. Интенсивность и длина световой волны определяется положением клетки в массе других клеток, то есть зависят от степени организованности ткани. В организованной структуре существуют центробежные градиенты концентрации О₂ и СО₂, которые играют исключительно важную роль в процессе дифференциации.

Таким образом, вторичный метаболизм в крупных агрегатах клеток с небольшим отношением площади к объему (S/V) отличается от такового изолированных клеток и мелких групп клеток в результате действия градиентов концентрации газов. Аналогично действуют градиенты регуляторов роста, питательных веществ, механического давления. Условия окружения у диспергированных клеток и клеток в виде агрегатов различны, поэтому пути метаболизма у них также различаются.

3. Регулировать выход вторичных метаболитов можно также, изменяя химический состав окружающей среды.

Изменение состава среды для каллусной и суспензионной культуры сопровождается определенными физическим манипуляциями с клетками, что может привести к повреждению или загрязнению культур. Эти трудности можно преодолеть, используя циркуляцию больших объемов питательной среды вокруг физически неподвижных клеток, что позволяет осуществлять последовательные химические воздействия.

4. В некоторых случаях возникают проблемы с выделением идиолитов.

При использовании иммобилизованных клеток относительно легко осуществляется обработка их химическим веществами, индуцирующими высвобождение требуемых продуктов. Это также снижает ингибирование по типу обратной связи, которое ограничивает синтез веществ вследствие накопления их внутри клетки. Культивируемые клетки некоторых растений, например, Capsicum frutescens выделяют вторичные метаболиты в окружающую среду, а система иммобилизованных клеток позволяет отбирать продукты без повреждения культур. Таким образом, иммобилизация клеток способствует легкой изоляции идиолитов.

Системы культивирования иммобилизованных клеток

Существует 2 типа систем культивирования иммобилизованных клеток:

1. Система культуры с плоской основой, клетки выращиваются в горизонтально расположенном сосуде.

2. Система колоночной культуры, где клетки выращиваются в вертикальном сосуде.

В обеих системах жидкая среда циркулирует вокруг физически неподвижных клеток.

Система культуры с плоской основой (рис. 13)

Рис. 13. Система культуры с плоской основой

Питательная среда капает под действием силы тяжести из цилиндрического сосуда объемом 70 мл (1) в стеклянный сосуд для культивирования (3) объемом 350 мл, где находятся клетки (40–50 г сырой массы), посаженные на субстрат — подстилку из нетоксичной полипропиленовой ткани. Питательная среда проникает сквозь ткань под действием капиллярных сил, снабжая клетки. После этого использованная питательная среда откачивается из сосуда для культивирования с помощью перистальтического насоса (2) обратно в резервуар и используется повторно.

Исследования, проведенные с этой системой, показали, что клетки Solanum niger, культивируемые на плоской основе (среда Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4-Д и кинетина) способны потреблять питательные вещества и быстро реагируют на недостаток ортофосфата. Увеличение сырой массы идет гораздо медленнее, чем в суспензионных культурах. Количество жизнеспособных клеток такое же и достигает 70–80 %. Количество алкалоидов через 7 суток культивирования достигает 12 мг/г сухой массы, в суспензии же через 18 дней культивирования оно составляет 10 мг/г сухой массы. В местах, где питательная среда капает прямо на клетки, через 3–4 дня культивируемая ткань становится темной и отличается от остальной, которая у S. niger окрашена в светло-бежевый цвет. Клетки в зонах капания часто бывают более компактны, содержат больше алкалоидов. Если клетки изолировать из зон капания и поместить в чашки Петри с агаром, содержание алкалоидов падает, при возвращении в прежние условия культивирования вновь аккумулируются высокие количества метаболитов.

Кроме того, в клетки вводились предшественники вторичных метаболитов. Отмечено, что синтез капсацина клетками Capsicum frutencens увеличивается в тысячи раз при добавлении в среду 5 мл изокаприновой кислоты. При этом капсацин не накапливается внутри клеток, а секретируется в питательную среду. Установлено, что клетки, иммобилизованные на плоской основе, способны потреблять питательные вещества из среды, в том числе и кислород, имеют низкую скорость роста, каллусоподобное расположение, способны к тесному межклеточному контакту. В целом, они имеют более высокий уровень синтеза вторичных метаболитов.

Несмотря на эти преимущества, промышленное культивирование имеет существенный недостаток: горизонтальная конструкция аппарата создает неудобства при работе и требует большой площади. Эти недостатки устраняются в другой системе. Система колоночной культуры (рис. 14)

Рис. 14. Система культуры в колонке

В такой системе возрастает число клеток, на которые капает среда, что увеличивает "зону капания", где происходит накопление больших количеств вторичных метаболитов.

Сосуд для культивирования из горизонтального превращается в вертикальный. В сосуде с питательной средой (1) 50 мл жидкой среды, которая под действием силы тяжести капает в вертикальную стеклянную колонку, содержащую иммобилизованные клетки (3). Среду собирают со дна колонки и вновь используют в цикле, перекачивая с помощью перистальтического насоса в резервуар со средой.

Как разместить клетки внутри колонки, чтобы капающая среда не спрессовала их в плотную массу на дне колонки? Закрепить в нейлоновую сеть, корзиночки, используя инертный, проницаемый и стабильный гель. Между корзиночками образуется воздушное пространство, сеточка структурирует гель, а клетки могут прорастать через корзиночки, контактируя друг с другом.