Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины — вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвенирования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель.

Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. — геном арабидопсиса, в 2000 году — геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы, это более сложная задача.

Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь за три-четыре дня можно синтезировать последовательность из 12–20 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы — ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов.

ГИБРИДИЗАЦИЯ КАК ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕОТИДОВ

Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °C и повысить pH до 13, то ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65 °C вело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК.

Для теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

ДНК-зонды применяются в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит, ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней.

В большинстве случаев мутации, ведущие к наследственным болезням, рецессивны, то есть болезнь развивается, если человек получает дефектные гены от обоих родителей. Аномальные эмбрионы лучше выявлять до рождения. Например, для серповидноклеточной анемии в мутантном гене, кодирующем бэта-цепь гемоглобина, последовательность ГАГ заменена на ГТГ. В этом случае синтезируют олигонуклеотид длиной около 20 оснований, метят радиоактивной меткой. Из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости, выделяют ДНК и используют ее для гибридизации. Если эмбрион дефектен, то тест будет положительным.

Анализ проводят по следующей схеме (рис. 42): исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. В отечествен ной литературе его принято называть «южный блоттинг». «Блоттинг» — в переводе с английского означает «промокашка», «саузерн» — «южный», в данном случае игра слов: фамилия ученого переводится как географическое направление.

Рис. 42. Блоттинг ДНК по Саузерну

Молекулы ДНК разгоняют в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют щелочью. Щелочь нейтрализуют и пластину геля покрывают листом нитроцеллюлозы. Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и связывается с нитроцеллюлозным фильтром. После прогревания фильтра при 80 °C в вакууме ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченой ДНК. Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д.

Аналогичным методом на нитроцеллюлозу переносят молекулы РНК (Северный блоттинг) и белка (Западный блоттинг). Из частей света осталась свободной только западная, хотя вакантными остались 2 класса макромолекул — углеводы и липиды.

Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована.

Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы, очень надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток — дорогая аппаратура для детекции.

МЕТОДЫ КЛОНИРОВАНИЯ ДНК

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить.