Охота на рыжего дьявола. Роман с микробиологами

По берегам речки стояли многовековые морщинистые вязы — священные деревья исконного населения этих мест — индейцев. Все это я узнал позднее, во время моих одиноких прогулок. Вотерманское водохранилище на долгие годы стало местом моего рыбацкого отдохновения в удачливые и горькие дни американской научной карьеры. Замечу, что в Провиденсе множество мемориальных мест связано с именем Роджера Вильямса (Roger Williams, 1603–1683), либерального протестантского проповедника, основавшего штат Род Айленд и провозгласившего равенство всех религий. Именно в Родайлендском портовом городе Ньюпорт был построен один из первых в Северной Америке еврейских храмов — синагога Туро (1762). На верхушке купола родайлендского Капитолия возвышается статуя Роджера Вильямса с посохом в руке.

Отдел патологии располагался на первом этаже госпиталя. Я вошел в приемную. Навстречу мне из кабинета выбежал толстяк с крупной головой, обрамленной каштановой гривой, закрывавшей плечи. Толстяк улыбался, раскинув мощные волосатые руки, торчавшие из зеленой? голубой? желтой? красной? безрукавки. Потом я узнал, что в любое время года Абби Майзел носит только безрукавки. Для каждого дня недели свой цвет. Никаких сорочек, пиджаков, галстуков! Толстяк затащил меня в свой кабинет, вызвал секретаршу по имени Линда и попросил принести кофе и данкин-донатсы. Потом я узнал, что данкин-донатсы (двоюродные братья наших пончиков) — самое любимое лакомство Абби. Он рассказал мне о своем отделе патологии, в котором было несколько лабораторий (микробиологии, иммунологии, биохимии, патологической анатомии и клиники), и в частности, о научной лаборатории, которая занимается очисткой и изучением фактора, стимулирующего рост и развитие В-лимфоцитов. Фактора, который открыл и описал Абби Майзел, и назвал BCGF (В-cell growth factor). Абби выделил BCGF из другого типа лимфоцитов — T-cells. За пончиками и кофе я рассказал Абби о своем образовании, о научной работе в области микробиологии, о годах отказа, о работе эндокринологом. Он живо откликнулся на тему отказников, повторяя с восхищением: «Рефьюзник! Рефьюзник!» И даже позвал секретаршу Линду полюбоваться на живого «несмотря на застенки КГБ» рефьюзника. Однако, ничего не пропускал мимо ушей, ухватившись за тему рекомбинантного инсулина, который мне так и не удалось «выбить» для своих больных. «Ну вот видите, как все связано в биологии и медицине: выделили ген, контролирующий продукцию человеческого инсулина, передали бактериям и начали получать дешевый и эффективный человеческий рекомбинантный инсулин. Нам тоже удалось выделить ген, контролирующий человеческий BCGF. Мы передали его кишечной палочке и получили впервые в мире рекомбинантный BCGF». Абби был очень эмоционален: вскрикивал, смеялся, размахивал руками, забрасывал в свою пасть данкин-донатсы, один за другим. На прощанье он дал мне оттиски с публикациями его лаборатории по BCGF и спросил, какие научные книги я хотел бы приобрести в первую очередь. Я сказал, что хотел бы почитать новейшие руководства по иммунологии, генетике и молекулярной биологии. Абби позвонил в книжный магазин Браунского университета, заказал книги и сказал, чтобы я заехал и забрал. Эти книги до сих пор стоят на полке в моем кабинете.

Дома я принялся читать статьи, которые получил от Абби. Открытие BCGF доктором Майзелем и его лабораторией, в то время находившейся в Раковом Центре при Техасском университете, описано в статье, опубликованной в журнале Nature за 1981 год. Смысл статьи заключается в том, что обнаружено некое вещество (клеточный гормон? фактор роста?), которое удалось выделить из человеческих Т-лимфоцитов и которое стимулирует рост и развитие популяции человеческих же В-лимфоцитов. Исследователи назвали его BCGF (фактор роста В-клеток). Более того, при помощи BCGF удалось получить такую клеточную культуру, происходящую из нормальных лимфоцитов, выделенных из человеческой крови, которая стала зависимой от BCGF и могла существовать в присутствии этого фактора роста как угодно долго. То есть, стала бессмертной, как раковые клетки. Особенно эффективен BCGF был, когда добавлялся к В-лимфоцитам, находившимся в логарифмической (S-фазе) роста. Эффект был пропорционален дозе добавляемого BCGF и продолжительности контакта BCGF с развивающейся культурой В-лимфоцитов. Культура ткани В-лимфоцитов, находившихся в S-фазе роста, активно абсорбировала BCGF, что означало наличие специфических рецепторов на поверхности этого типа клеток крови. Очевидно было, что открытие BCGF имеет важное значение не только для гематологии, иммунологии, но и онкологии. С одной стороны, BCGF мог быть использован при терапии различных типов лимфоцитарной недостаточности, ведущей к пониженной выработке антител и поэтому — резкому ослаблению иммунитета. С другой стороны, BCGF может еще более активизировать рост злокачественных заболеваний крови, например, лимфомы Бюркитта (Burkitt’s lymphoma). Чрезвычайно интересна была статья (первый автор — Сарендра Шарма), посвященная молекулярному клонированию и продукции BCGF культурой кишечной палочки (Escherichia coli), то есть получению рекомбинантного человеческого BCGF (Science, 1987). Фактор роста В-клеток оказался сравнительно легким полипептидом (12 килодальтон), амино-терминал которого состоял из 124 аминокислот, а карбокси-терминал — из 32 аминокислот. Для селекции микробных колоний с оптимальной степенью активности BCGF авторами применялся метод, основанный на измерении степени внедрения в ДНК В-лимфоцитов (тест-культура) радиоактивного тимидина. То есть, чем активнее образец BCGF, тем больше репликаций он стимулирует в ДНК тест-культуры, и тем чаще выстукивает свою морзянку счетчик Гейгера. Проанализировав статью в журнале Science, я не мог предположить, что подобными экспериментами мне придется заниматься ближайшие три года.

Прочитав статьи, любезно подаренные мне доктором Майзелем, я отправился в Браунскую научную библиотеку. Оказывается, было еще несколько лабораторий в США и Японии, которые тоже занимались поисками факторов, стимулирующих рост В-клеток. Молекулярный вес одного «параллельного» BCGF был близок к описанному Майзелем и соавторами. Другие BCGF были в 2 и 3 раза тяжелее: 26 и 50 килодальтон.

Все это было чрезвычайно интересной областью биологии. В особенности, методология рекомбинантной ДНК, когда манипуляции на уровне генов могли быть метафорически уподоблены микрохирургии. Правда, еще великий Грегор Мендель (1784–1846) применял в своих экспериментах с горошком не только селективное скрещивание, но и простейшую хирургическую технику. В 1940–50-е годы появились наблюдения о возможности обмена участками ДНК между бактериями. Этот этап биологии я застал, работая в Институте имени Гамалея и передавая пенициллиназные плазмиды от одного вида микроорганизмов к другому. Начиная с 1970-х манипулирование с изолированными сегментами ДНК достигло такого уровня, что привело к возможности клонирования ДНК. Причем, оказалось реальным вводить участки человеческой ДНК в состав генетического материала микроорганизмов. Именно этим и занимались в лаборатории доктора Шармы (Sharma), входившей в отдел патологии Абби Майзеля.

Мы вернулись из Нью-Йорка, подходил Новый 1988 год. Доктор Майзел не звонил. Я, конечно, нервничал. Правда, была возможность пойти в одну из лабораторий при Мириам госпитале. Но я почему-то настроился на работу с рекомбинантным BCGF. Наконец, 28 декабря позвонила секретарша Майзеля — Линда, которая вполне в духе американской вежливости и вальяжности сначала поболтала со мной о своих польско-литовских предках, как будто бы они вышли из той же деревни, что и я, и только под конец сказала, что доктор Майзел приглашает меня для окончательного интервью. Я приехал. В кабинете Абби сидели еще двое. Абби познакомил меня с ними. Один из них был Сарендра Шарма, постоянно улыбавшийся моложавый господин, спросивший меня, работал ли я когда-нибудь с микроорганизмами. Я ответил, что работал более двадцати лет. «А с культурами тканей?» «Нет, не работал». Другим был Николас Куттаб (Kouttab), коренастый человек средних лет с мягким доброжелательным взглядом темных глаз и волнистыми седеющими волосами. С Ником (так он просил называть его) сразу же завязалась оживленная беседа. Я рассказывал ему о давних экспериментах по выработке антител к стафилококовым токсинам. Я понимал, что решается моя судьба. Когда наступила пауза, Абби спросил: «Ваше мнение, шеф?» Потом я узнал, что Абби, как и другие, чаще всего называет Шарму «шеф». Никогда по имени, очень редко по фамилии. «Ваше мнение?» «Попробуем, — ответил Шарма. — Пусть приходит в мою лабораторию второго января». Ник дружелюбно поддержал: «Конечно, конечно! Я в любое время помогу». Оба завлаба ушли. Абби подсел ко мне поближе и, как давнишний знакомый, похлопал меня по плечу: «Не беспокойтесь, Давид. С Шармой будет нелегко, но я всегда помогу. Ник — отличный парень. Между прочим, родился в арабском квартале Иерусалима». Абби вызвал Линду: «Оформляем на работу в лабораторию со второго января. Зарплата такая-то и все бенефиты». Мы пожали друг другу руки, и я уехал.

Утром второго января 1988 года я вошел в лабораторию доктора Шармы. Лаборатория располагалась в цокольном этаже, но не главного, а так называемого «северного» корпуса, большую часть которого занимал Дом для престарелых и амбулаторное отделение госпиталя. Это было довольно мрачное красно-кирпичное здание. А в лаборатории, окна которой были на уровне земли, даже летом можно было работать только при электрическом освещении. Встретила меня секретарша доктора Шармы — Дороти, пожилая седовласая еврейская дама, которая тотчас сообщила мне, что ее предки, эмигрировавшие в начале века (тогда — XX-го), произошли из города Житомира, и поэтому она считает себя русской. Эту некоторую вольность в определении своей национальности, корней и места происхождения предков я наблюдал нередко у американских евреев и после. Никого еще в лаборатории не было, кроме одного лаборанта по имени Джим Джексон, который буркнул мне что-то в ответ на приветствие, не протянув руки. Дороти показала мне лабораторию, которая занимала чуть ли не десять комнат, среди них главная, разделенная на отсеки с лабораторными столами и приборами. В одном из отсеков возился со вчерашним электрофорезом Джим Джексон. В самом конце главной лаборатории находилась «темная» комната для проявления рентгеновских пленок. В главной лаборатории было несколько стеклянных боксов с вытяжкой для работы с культурами тканей и бактериями. Мощные высокоскоростные центрифуги, термостаты, холодильники и другие приборы, со многими из которых я никогда не работал, размещались вдоль стен и на столах лаборатории. Между главным лабораторным помещением и остальными комнатами находился кабинет, на закрытой двери которого была дощечка: Сарендра Шарма (Sarendra Sharma, Ph.D.) Затем следовал кабинет Дороти, напротив которого находилось помещение, игравшее одновременно роль библиотеки и кафе. На полках, подвешенных к стенам, стояли научные журналы: Science, Nature, Immunology, Proceedings of the American Academy of Science, и др. Тут же на столах, прилегающих к стенам, стояли компьютеры, которые я более или менее освоил в лаборатории доктора Зингера и в Браунской научной библиотеке. На одном из столов стояла большая кофеварка, запасы кофе в банках, сахар, сухое молоко, галеты. Кофейник источал пар и дразнящий аромат кофе. «Джим сварил кофе», — сказала Дороти и выразительно посмотрела на меня. Я не знал, что ответить. Дороти добавила: «Кофе хорошо промывает мозги после виски». В центре комнаты стоял большой эллипсоидный стол, удобный для заседаний лаборатории. И совместных кофепитий. Как я потом узнал, в лаборатории отмечали дни рождения с непременным тортом-мороженым и кофе. Дальше следовали кабинеты сотрудников. И еще дальше, в противоположном от кабинета Шармы конце лаборатории, была маленькая самостоятельная лаборатория доктора Акико Такеда, которая занималась биохимическими аспектами, связанными с действием BCGF на клетки лимфоцитов.

Понемногу начали собираться сотрудники и лаборанты: Джон Морган (Morgan), Силвия Миллс (Mills), Арон Рум (Room) и, наконец, Шарма. Он был немногословен. Чем-то угнетен. Обойдя лабораторию, показал мне отсек, один стол которого предназначался для моих экспериментов, а другой — параллельный — для ведения лабораторного журнала, чтения, словом, для размышлений над листом бумаги с карандашом в руке. Шарма пригласил меня в кабинет. Долго рассказывал о полученном в его лаборатории рекомбинантном BCGF. На первых порах мне предстояло определять активность разных образцов рекомбинантного BCGF (rBCGF) и сравнивать ее с активностью натурального, клеточного (BCGF) cBCGF, полученного из человеческих лимфоцитов, авторство которого принадлежало Абби Майзелю. Из многословных рассуждений Шармы выходило, что хотя по всем данным молекулярно-биологического анализа рекомбинантный rBCGF должен быть лучше: активнее и экономичней, чем препарат натуральный, полученный из лимфоцитов, на деле, на каком-то этапе очистки rBCGF активность его теряется или определяется на невысоком уровне. С этой проблемой мне надо было иметь дело и по возможности ее разрешить. Единственной привязкой мог служить мой опыт работы с пенициллиназой стафилококков. Рекомбинантный BCGF продуцировался кишечной палочкой, которой были переданы гены человеческого (cBCGF). У доктора Шармы и его сотрудников была обширная коллекция образцов этой кишечной палочки, в ДНК которой находился и должен был функционировать ген, контролирующий продукцию rBCGF. Образцы трансформированных субкультур кишечной палочки были лиофилизированы и заморожены. Мне предстояло искать иголку в стоге сена, то есть надеяться, что очередной взятый из коллекции образец бактериальной культуры окажется продуцентом с высокой степенью активности. Каждый эксперимент сводился к тому, что прежде всего я выращивал в термостате с активным доступом кислорода культуру E. coli, «беременную» rBCGF, Бактерии в термостате-качалке постоянно перемешивалась при температуре 37 градусов Цельсия. В лабораториях США, как и во всем мире, применяется десятичная система исчисления мер, весов и объемов в отличие от повседневной жизни. Когда дело касается продуктов питания, промышленных товаров, бензоколонок, до сих пор употребляются меры веса, длины или объема в дюймах, футах, милях, фунтах, унциях и галлонах. Выращенная бактериальная масса отделялась центрифугированием от питательной среды. Клетки разрушались ультразвуком или другими методами (растирание с мелкими частицами кварца, замораживание и оттаивание и др.). Затем полученная масса, состоящая из клеточных стенок и цитоплазмы (содержимое бактериальной клетки), центрифугировалась при очень высокой скорости, надосадочная жидкость фильтровалась через сульфонат-сефарозную колонку, и в конце концов полученный материал проверялся на биологическую активность. Для этого вновь полученная серия препарата rBCGF добавлялась к культуре растущих В-лимфоцитов вместе с радиоактивным тимидином, и счетчик показывал, насколько проверяемый образец биологически активен по сравнению с натуральным cBCGF, который принимался за эталон.

Каждое утро я приходил в лабораторию с надеждой, что сегодня обязательно повезет, и очередной образец rBCGF окажется счастливым — будет обладать высокой активностью. В конце дня я приходил в кабинет Шармы с результатами очередного эксперимента, цифры которого, зафиксированные на принтере, не радовали ни его, ни меня. В лаборатории привыкли к хроническому невезению, которое было продолжением и подтверждением невезения нескольких человек, занимавшихся до меня очисткой rBCGF. Закрадывалось сомнение, наверняка не только у меня: «А не мираж ли это — рекомбинантный BCFG?» Когда я выходил из радиологической лаборатории со свежеотпечатанными результатами очередного эксперимента, из разных углов «большой» лаборатории раздавалось: «Ну как, Дэйв, опять по нолям?»

Я работал все семь дней недели, практически без выходных, надеясь, что, увеличив количество экспериментов, по закону больших чисел доберусь до счастливого образца, обладающего хорошей активностью. Все было напрасно. Заходя в «большую» лабораторию или сталкиваясь со мной в коридоре, в библиотеке, около кофеварки или за компьютером, доктор Шарма обходил меня стороной. Хроническое невезение и боязнь потерять работу (в то время я был единственным кормильцем в нашей семье) до того угнетали меня, что я впал в полную меланхолию. Возвращаясь поздно вечером домой, после работы, а сверх того — после Браунской научной библиотеки я, наскоро проглатывал ужин и валился на диван лицом к стене. Хорошо, что Мила и Максим поддерживали меня. Но Максим с зимнего семестра перешел жить в студенческое общежитие, а у Милы были свои не менее травматические проблемы с поиском постоянной работы.

На исходе был март 1988 года. В полуподвал лаборатории скользнул луч солнца. Что-то встряхнуло меня. Какая-то неясная мысль шевельнулась в душе. Именно так: мысль-предчувствие. Эмоция, трансформирующаяся в мысль, проклюнулась во мне. Как будто накануне новых стихов. Ясно вспомнилась во всех деталях работа с пенициллиназой. Тогда ведь тоже приходилось в гетерогенной (неоднородной) популяции культуры стафилококков разыскивать активных продуцентов этого фермента, разрушающего пенициллин. Я разработал тогда микрометод, позволивший анализировать на уровне изолированной колонии неоднородную популяцию микроорганизмов. Как известно, колония — это потомство единственной изолированной микробной клетки. Значит, если мне удастся среди сотен колоний, выросших из одного образца потенциального продуцента rBCGF на поверхности питательного агара в чашке Петри, обнаружить хотя бы одну нужную колонию — задача будет решена. Почти решена. Я предположил, что BCGF — этот фактор роста и развития В-лимфоцитов должен продуцироваться во внешнюю среду. Хотя бы в небольших количествах, но должен. Нужно обнаружить колонию — активного продуцента. Для прежних экспериментов, когда проверялась активность rBCGF, из очередного образца кишечной палочки выращивалась большая масса бактерий и применялись сульфат-сефарозные очистительные колонки, позволявшие пропускать большие объемы предполагаемого «сырого» rBCGF. Но если среди этих миллионов клеток и была одна или несколько обладавших активностью, они терялись в массе «пустышек». Я приготовил микроколонки из пастеровских пипеток и наполнил их той же самой сульфат-сефарозой. Колонии бактерий, выросшие на питательном агаре, метились номерами, небольшая часть материала колонии высевалась в пробирку с питательным бульоном, а большая часть колонии переносилась в раствор, разрушавший клеточную стенку бактерии и освобождавший цитоплазму. Затем раствор фильтровался через микроколонку. Активность полученного образца проверялась на способность стимулировать рост и развитие В-лимфоцитов. Мой стол был загроможден штативами с микроколонками и пробирками, в которые фильтровались лизаты rBCGF из анализируемых колоний. Картина напоминала скульптуру модерниста под названием: стеклянный еж. Джим Джексон присвистывал и подмигивал иронически. Джон Морган сочувственно похлопывал меня по плечу. Остальные молчали, стараясь побыстрее миновать моих «ежей» и многозначительно переглядываясь. Доктор Шарма надолго запирался то с тем, то с другим сотрудником. Чаще с Джимом или Сильвией. Наверняка, советовался, как быть со мной? Я анализировал колонии: выращивал, фильтровал, проверял активность.

И вдруг одна колония оказалась активным продуцентом rBCGF. На фоне монотонного плато, показывающего внедрение радиоактивного тимидина в ДНК тест-культуры В-лимфоцитов, выскочили цифры, намного превышающие активность стандартного cBCGF. Я рассеял на поверхности питательного агара оставшуюся часть колонии явного продуцента. Примерно четверть выросших колоний активно продуцировала rBCGF. Еще один круг экспериментов с применением первого закона Менделя — закона «одинаковости» — селекции колоний, продуцирующих активный rBCFG, и у меня в морозильнике набралась внушительная коллекция лиофилизированных субкультур кишечных палочек, продуцирующих rBCGF. Вся лаборатория в течение недели занималась повторением моего эксперимента. Каждому было поручено независимо друг от друга воспроизвести селекцию продуцента rBCGF. Результаты упорно повторялись. Анализ ДНК продуцентов подтвердил, что ген rBCGF интегрирован в геноме бактерий-продуцентов. Доктор Шарма позвал меня к себе в кабинет, затворил дверь и сказал с пафосом, что никогда не забудет того, что я сделал для него и лаборатории. Мой curriculum vitae вместе с сопроводительным письмом Абби Майзеля были посланы в Браунский университет, чтобы утвердить меня в звании научного сотрудника.