Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Несмотря на незначительную толщину слоя, запись УФ-спектров возможна с помощью чувствительных быстрых сканирующих детекторов или ДМД.

Применением многоволнового детектора в КЭ могут быть привнесены известные из ВЭЖХ преимущества. К ним относятся облегчение оптимизации буфера за счет автоматического распознавания пика, контроль гомогенности пика за счет сравнения спектров в пределах пика, а также оптимизация чувствительности для веществ с сильно различающимися УФ-спектрами за счет интегрирования сигналов при различных длинах волн.

Из-за осложнений в процессе записи данных в случае быотросканирующего детектора измеряется только ограниченное количество точек в секунду. Поэтому шумы детектора при приеме спектральной информации при переходе от одноволнового режима к режиму быстрого сканирования увеличиваются примерно в 10 раз. Кроме того, спектральные данные из-за медленной записи при появлении пика с очень крутыми краями могут быть представлены искаженно. Диодная матрица, напротив, позволяет записывать многоволновой спектр в режиме реального времени. При этом УФ-спектры не могут искажаться за счет медленной записи данных. Так как именно при КЭ, когда из-за высокой эффективности пиков и короткого времени анализа возникают очень резкие края пиков и может реализоваться ширина пиков в несколько секунд, особенно важна быстрая запись спектров.

Пробы, не обладающие поглощением в УФ-области, можно обнаружить с хорошей чувствительностью на коммерческих УФ-детекторах с помощью непрямого УФ-детектирования. Для этого к буферу добавляют электролит, обладающий УФ-поглощением, подвижность которого близка к подвижности разделяемой пробы. Количество добавленного вместо пробы электролита (механизм вытеснения) должно быть чрезвычайно мало из-за соблюдения условия необходимой электронейтральности, так что буфер в данном случае будет обладать более высокой прозрачностью, что выражается в появлении отрицательного пика. Это схематично представлено на рис. 28. Примеры применения даются в разделе, посвященном анализу ионов. Чувствительность обнаружения при непрямом УФ-детектировании зависит от молярного коэффициента экстинкции добавляемого фонового электролита, поглощающего в УФ-области, и соответствует чувствительности обнаружения нормального УФ-поглощения.

Рис. 28. Принцип непрямого УФ-детектироваиия.

6.5.2. Флуоресцентное детектирование

Помимо УФ-детекторов, с недавнего времени выпускаются также флуоресцентные детекторы. Отличия от детекторов ВЭЖХ заключаются в основном в длинах волн источников света. Кроме обычно используемых дейтериевой и импульсной ксеноновой ламп предлагаются также существенно более дорогие лазерные системы, причем возбуждение в них происходит в видимой области длин волн, так что должны применяться соответствующие производные проб.

Возможно также непрямое флуоресцентное детектирование, при этом речь может идти об универсальной методике детектирования, если имеется в распоряжении подходящий флуорофор без эффекта тушения.

6.5.3. Прочие методы детектирования

Предлагаются методы электропроводности, а также другие электрохимические детекторы. Однако в настоящее время они еще коммерчески недоступны. В качестве примера здесь можно упомянуть определение следов щелочных и щелочно-земельных металлов с помощью микроэлектродов непосредственно в капилляре.

При детектировании по электропроводности возникает проблема, которая заключается в том, что помимо фоновой электропроводности электролита обнаруживается и некоторая электропроводность в зоне вещества. Техника подавления этого нежелательного явления, используемая в ВЭЖХ, здесь не применима. Успешное использование детектора по электропроводности в КЭ описано много раз. С помощью амперометрического детектирования удается прямое обнаружение мейромедиаторов в нервных клетках, причем толщина капилляров, которые применяются для разделения, составляют 5 мкм.

Рис. 29. Конструкция интерфейса соединения КЭ-МС.

Низкие скорости потока (100 нл/мин) делают возможным сочетание КЭ с масс-спектрометрией (МС). Главная проблема при таком сочетании состоит, однако, в том, что в переходнике из капилляра в источник ионов элюент не будет всасываться из капилляра за счет существующего там вакуума. При падении давления 1 бар в капилляре длимой 1 м (внутренний диаметр 50 мкм) линейная скорость потока составляет 1 см/с. Возникающий в результате этого ламинарный параболический профиль потока привел бы к заметной потере эффективности. По этой причине перед ионизацией нужно проводить "улучшение" потока в капилляре. Ионизация электрораспылением позволяет осуществлять МС-детектирование биополимеров в результате образования множества заряженных частиц. В качестве примера показано разделение четырех фосфониевых ионов. Если записать общий ионный ток, то получим только два пика. Селективное детектирование отдельных соединений возможно при определенном соотношении масса/заряд (правая часть рис. 30).

Рис. 30. МС-детектирование при КЭ:

_{а) универсальное детектирование при регистрации полного ионного тока; б) Активное детектирование при регистрации отдельных соотношений массы к заряду.}

Рассматривались также другие методы детектирования (спектроскопия комбинационного рассеяния, измерение радиоактивности в режиме реального времени, круговой дихроизм, коэффициенты преломления света, капиллярная вибрация). Их возможности для рутинного использования в настоящее время еще не определены.

Само собой разумеется, что могут использоваться УФ-неактивные и нефлуоресцирующие пробы, если применять реагенты, употребляемые обычно для получения соответствующих производных перед разделением хромофоров и флуорофоров. В результате этого, однако проявляют себя недостатки предколоночного происхождения, известные из ВЭЖХ. Специальные реагенты для электрофореза, имеющие помимо хромофора еще и соответствующий заряд, являются темой для обсуждения.

При детектировании на основе лазерной флуоресценции для определения с помощью возбуждения на длине волны около 380 нм в большинстве случаев пробу перед разделением необходимо подвергнуть воздействию флуоресцентной метки. В качестве примера назовем разделение 3-(4-карбоксибензоил)-2-хинолин-карбоксиальдегид (КБХКА) — производных аминокислот.

Описаны первые экспериментальные разработки для получения производных после прохождения колонки, однако они пока еще не пригодны для использования вне стен исследовательских лабораторий.

В таблице 12 представлены достижимые границы обнаружения наиболее часто встречающихся систем детектирования. Из таблицы видно, что благодаря небольшому объему может достигаться высокая чувствительность по массе. Концентрационная чувствительность находится в пределах ВЭЖХ.

6.6. Количественный анализ

На воспроизводимость получаемых результатов влияет множество факторов: разница в электропроводности между разделительным электролитом и раствором пробы, большое различие в концентрации компонентов пробы и их электрофоретическая подвижность, различие в составе пробы. С другой стороны, преимущества КЭ проявляются тогда, когда необходимо проанализировать очень малые объемы проб; например, при 5 анализе ионов в дождевых каплях или в биологических пробах.