Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Белки в растворе все же нарушают воспроизводимость разделения. На рис. 54 показаны времена миграции и площади пиков кальция для первых восьми вводов пробы.

Рис. 54. Разделение разжиженной пробы крови, характеристические кривые времени миграции/площади пика для проверки воспроизводимости с и без кондиционирования капилляра. Условия аналогичны приведенным на рис. 53.

В результате адсорбции белков, которые при каждом вводе пробы достигают капилляра, силанольные группы на стенках капилляра, ответственные за ЭОП, все более и более блокируются. По этой причине ЭОП замедляется, и ионы движутся к детектору медленнее. Уменьшение скорости движения напрямую отражается на площади пиков. С увеличением времени миграции ионы медленнее проходят через детектор, из-за чего площадь пиков растет. Этим объясняется ход кривых зависимости площади пика от времени миграции, приведенных на рис. 54.

Нормировка площади пика на время миграции является лишь вычислительным приемом с результатами анализа. Однако, причина изменения времени миграции все же остается. Несмотря на это, путем такой нормировки ОСО площади пика уменьшается с 6.2 % до 2.8 %. Приемлемым решением этой проблемы является подготовка капилляра перед каждым пуском. В анализах, описанных до настоящего времени, для кондиционирования капилляра применяли только промывание разделяющим буфером в течение 3 мин.

Для удаления белков из капилляра после каждого разделения во второй серии измерений капилляр сначала промывали в течение 5 минут 0.1 М NaOH и затем 5 минут разделяющим бусрером. Этим способом кондиционирования можно было удалять со стенок капилляра мешающие вещества, внесенные пробой, и в конце концов восстановить свойства капилляра новым буфером. Характеристическая кривая зависимости площади пика от времени миграции в этих случаях не имеет наклона, времена, как и площади пиков, колеблются произвольно. Воспроизводимость площади пика для кальция составляет после 8 вводов пробы 2.0 %. Если площадь нормировать дополнительно на время, это значение составляет 1.5 %.

Амины также могут легко протонироваться, и, так же как ионы металлов или аммония, их можно легко разделять. Типичные значения pKs для алифатических аминов лежат в области от 9.5 до 10.8. На рис. 56 в качестве примера представлено разделение ионов металлов, аминов и аминоспиртов. И в данном случае непрямое УФ-детектирование достигается имидазольной буферной системой. Благодаря высокому разрешению пиков, все вещества, как видно из рисунка, отделены друг от друга на уровне базисной линии.

8.3. Сопоставление методов прямого и непрямого Уф-детектирования

Сопоставление нижней границы детектирования (НГД) и верхней границы линейной области удается провести при анализе некоторых аминов, плохо поглощающих в УФ-области. Аналогичные измерения со щелочными или щелочно-земельными ионами провести невозможно из — за их слишком малого УФ-поглощения. Из данных, приведенных в таблице 21, видно, что эта ионы при 200 нм можно детектировать прямым способом. В боратном буфере анализ длится до 5 мин. Непрямым УФ-детектированием при 254 нм с эфедрином в качестве буфера нижняя граница детектирование уменьшается в 50 раз (примерно до 1 мг/л). Линейная область в методе прямого УФ-детектирование распространяется от 1.4 до 1.6 десятичных порядков, а при непрямом УФ-детектировании — от 1.7 до 2.0 десятичных порядков.

Рис. 55. Разделение разжиженной пробы крови, воспроизводимость времен миграции, площади пика и нормированные площади пика. Условия аналогичны приведенным на рис. 53.

Из этого видно, что и при непрямом детектировании можно работать в линейной области.

Рис. 56.Разделение низших аминов и ионов металлов.

_{Условия:} прибор КЭ Mill/pore Waters Quanta 4000; капилляр: 75 мкм, 50/58 см; поде: 436 В/см, буфер: 5 мМ имидазол/серная кислота, pH 4,7; ввод пробы гидростатический, 30 с, непрямое детектирование 214 нм, проба: 1.0–2.5 ррт; 1 — кадий, 2 — натрий, 3 — диметиламин, 4 триметиламин, 5 — кальций, 6 — магний, 7 — литий, 8 — диэтиламин, 9 — триэтиламин, 10 — диэтаноламин, 11 — триэтаноламии.

Условия разделения: прибор КЭ — Beckman P/FCE 2000; капилляр 75 мкм, 50/57 см; поле 439 В/см; ввод пробы давлением 8 с, буфер при прямом УФ-детектировании — 50 мМ борат, pH 9.5, при непрямом УФ-детектировании — 5 мМ эфедрин/серная кислота, pH 7.5; прямое УФ-детектирование — 200 нм, непрямое — 254 нм; пробы — амины в воде.

9. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) белков

В КЗЭ белков между молекулами пробы и стенками капилляра могут возникнуть сильные, в основном электростатические, взаимодействия. Они происходят между отрицательно заряженными сила-нольными группами поверхности и положительно заряженными функциональными группами пробы. Некоторую дополнительную роль могут играть также неспецифические взаимодействия с образованием водородных мостиков или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Адсорбция молекул белков на стенках капилляра может отрицательно сказываться на разделении при КЭ и поэтому нежелательна. Она приводит к ухудшению воспроизводимости времен миграции, уширению и асимметрии пиков, и даже к необратимой адсорбции компонентов пробы. Поэтому при работе с немодифицированным капилляром рекомендуется после каждого проведенного разделения при вводе пробы из биологических матриц основательно промыть капилляр (например, NaOH). При этой операции молекулы, адсорбированные на стенках капилляра, удаляются, и воспроизводимость системы улучшается. Существует несколько возможностей подавления нежелательных взаимодействий между белками и стенками капилляра.

9.1. Оптимизация разделения в немодифицированных капиллярах

9.1.1. Значения pH

При значениях pH выше изоэлектрической точки (р!) белки существуют в анионной форме, то есть имеют те же заряды, что и стенки капилляра и во время разделения отталкиваются от них. Поскольку очень многие белки имеют значения pi, лежащие в области от нейтральных до слегка кислых, буфер для КЭ должен иметь явно щелочные значения pH (pH 9-11). Однако, в случае сильно основных белков (pH > 10) эта возможность достигает своих естественных границ. Кроме этого, в данном случае дают себя знать высокая электропроводность применяемого буфера и отрицательно сказывающееся явление денатурирования, которое может возникнуть в этих характерных условиях. На рис. 57 показано разделение белков в немодифицированном капилляре при pH 11.5.

Рис. 57. Разделение белков при pH 11.5 в немодифицированном капилляре.

_{Буфер: 100 мМ борат, pH 11.5; пробы: 1 — DMF, 2 — РНК крупного рогатого скота, 3 — миоглобин кита, 4 — миоглобин лошади, 5 — кональбумин, 6 — ?-лактоглобулин, 7 — бычий сывороточный альбумин (БСА), 8 — ферритин, 9 — ?-амилоглюкозидаза.}