Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Рис. 35. Схема КЗЭ:

_{а) начальное состояние, б) различная миграция отдельных зон образцов, в) профиль напряженности поля (сплошная линия) и pH (пунктирная линия) в сечении разделительной камеры.}

1.1. Влияние pH

Влияние pH на перенос пробы к детектору объясняется двумя причинами. Как уже отмечалось, на разделение, основанное на электрофоретической миграции, в большей или меньшей степени накладывается ЭОП, на величину которого влияет диссоциация поверхностных силанольных групп. Кроме того, подвижность ионов определяется их степенью диссоциации в несущем электролите и, следовательно, его значением pH. Поэтому можно оптимизировать разделение изменением величины pH и вида буфера. Наибольшее различие в способности к перемещению для слабых электролитов, т. е. наивысшую селективность получают тогда, когда значение pH буфера лежит между значением pKs компонентов пробы (Ks — константа диссоциации). Это поведение аналогично разделению в ионнообменной хроматографии.

Рис. 36. Зависимость подвижности двух слабых кислот от значения pH.

Достижимое разрешение двух пиков можно рассчитать по соотношению:

R = 2(t₂ — t₁)/(w₁ + w₂)

где t — время миграции и w — ширина пика у его основания.

Переходя к уравнению и рассчитывая время миграции из подвижностей, получим:

Наилучшее разрешение получается, когда ионы движутся против ЭОП. Высокое напряжение также приводит к улучшению разрешения. Рис. 37 показывает рассчитанное разрешение пары пиков. Пик 2 перемещается при этом с подвижностью 0.5 см²/кВс, а пик 1 — с подвижностью, составляющей от 0 до 30 % от минимальной, в поле 300 В/см в капилляре длиной 50 см (D=10^{– 5} см²/с^{– 1}).

Рис. 37. Разделительная способность R двух пиков в зависимости от ЭОП и разницы подвижностей.

Недиссоциированные компоненты пробы движутся через капилляр со скоростью ЭОП. ЭОП зависит, как было показано, также от pH и других свойств электролита, особенно от ионной силы. Возможности, которые появляются из-за наложения электрофоретического перемещения и ЭОП, можно продемонстрировать на примере разделения нуклеотидов. Если ЭОП направляется к катоду, нуклеотиды движутся к аноду, причем наиболее быстро движется трифосфат благодаря наиболее высокому заряду.

Даже при высоком значении pH (>10) ЭОП недостаточен для того, чтобы перенести трифосфат к детектору на катоде. Если электрофоретическая подвижность моно- и дифосфата меньше, чем ЭОП, оии переносятся к детектору, которого достигают через различное время. Разделение этой пробы показано на рис 38. При таких экспериментальных условиях векторного вклада ЭОП недостаточно для переноса трифосфата, который в данном случае перемещается в анодное пространство. При переполюсовке можно определить трифосфат, в то время как ди- и монофосфаты вместе с ЭОП движутся в другом направлении.

При добавлении веществ, образующих ионные пары, подвижность изменяется так, что при анализе могут разделяться все нуклеотиды. С помощью обращения ЭОП в результате модификации поверхности и одновременного изменения направления поля возможно разделение ионов с сильно различающимися подвижностями (см. анализ ионов).

Рис. 38. Разделение некоторых нуклеотидов с помощью КЗЭ.

7.2. Влияние концентрации буфера

На рис. 6 уже было показано влияние ионной силы на ЭОП. Подвижность ионов должна зависеть от концентрации буфера. Важной является также ранее описанная зависимость интенсивности пиков от концентрации буфера. С одной стороны, концентрацию буфера нужно выбирать настолько высокой, чтобы значение pH оставалось постоянным и по возможности минимизировались бы эффекты перегрузки, но, с другой стороны, чтобы ЭОП еще допускал быстрое время анализа и не появлялось бы дополнительное уширение полос из-за тепловыделения. При этом, естественно, в капиллярах с маленьким внутренним диаметром применяется высокая концентрация буфера. Для большинства применяемых капилляров с внутренним диаметром 75 мкм применяются обычно буферы с концентрациями от 10 до 50 мМ.

7.3. Выбор буфера

При выборе буфера следует обращать внимание на множество факторов. Как было показано, для достижения хороших результатов разделения необходимо совпадение подвижностей ионов пробы и буфера. Концентрация ионов буфера должна быть больше, чем концентрация ионов в растворе пробы. Это приводит к симметричным четким зонам, так как только тогда на ионы пробы не влияет электрическое поле. С другой стороны, высокая ионная сила при заданном падении напряжения означает высокую плотность тока и поэтому увеличение джоулева тепла. Этот эффект можно просто измерить как отклонение от закона Ома. Преимущество буфера на основе органического цвиттериона (например, 3(-циклогексиламино)-1-пропан-сульфокислотный буфер) с его очень маленькой электропроводностью является решающим при использовании капилляров с большим внутренним диаметром.

Значение pH определяет заряд пробы и поэтому существенно изменяет селективность разделительной системы. Обзор влияния отдельных параметров на систему разделения приведен на рис. 39.

Поскольку время анализа обратно пропорционально приложенному напряжению, при низкой концентрации буфера всегда достигается более короткое время анализа.

Резюмируя, можно предъявить следующие требования к буферной системе в КЗЭ:

— селективность для разделяемых ионов,

— стабилизация значения pH, буферная емкость (воспроизводимость),

— малое УФ-поглощение при детектируемых длинах волн,

— соответствие между подвижностями ионов пробы и буфера,

— противоионы должны обладать очень малой подвижностью (отсутствие тока),

— воспроизводимое получение буфера.

7.4. Области применения

Электрофорез в гомогенной буферной системе при унифицированной напряженности поля является стандартным методом, который особенно эффективен при разделении маленьких молекул с постоянным зарядом. Поэтому можно без больших трудностей разделить алифатические и ароматические карбоновые кислоты, сульфокислоты, аминокислоты, фенолы, нуклеотиды и амины. Показательные примеры разделений, имеющих важное прикладное значение, приведены в двух обзорных статьях Кура (см. список литературы).

Рис. 39. Факторы, влияющие на КЗЭ.

Примером может служить разделение природной смеси танинов, представленное на рис. 40. Показаны также УФ-спектры, записанные в режиме реального времени с помощью ДМД.

Рис. 40. Разделение смеси танинов (галловых кислот).

Как типичное применение КЗЭ, в следующей главе будет описано разделение ионов, не имеющих собственного УФ-поглощения. С помощью КЗЭ может также осуществляться разделение белков, если подавляется обменное взаимодействие между пробой и стенками капилляра. Этому разделению также посвящена отдельная глава.