Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2007 №9

Иными словами, не смотря на то, что я применял длительную стерилизацию под давлением и использовал значительные количества перекиси, мне так и не удалось достичь стабильных, без заражений, результатов на зерне ржи, которое я приобретал в местном магазине.

К счастью, у меня была возможность использовать другое зерно, называемое мягкой белой пшеницей. Оно имеет гораздо большую первоначальную влажность, чем рожь (30 % против 8 % у ржи), но вместе с тем, выглядит значительно чище.

Хорошие результаты с мягкой белой пшеницей были достигнуты тогда, когда перед стерилизацией в скороварке я замачивал это зерно на ночь в определенном количестве горячей воды из-под крана, или же когда я замачивал зерно в избытке горячей воды. Субстрат, свободный от заражения, получался каждый раз, когда я использовал этот вид зерна.

К сожалению, мягкая белая пшеница не всегда бывает в продаже, а кроме того, к ней нередко подмешивают твердые коричневые сорта пшеницы, т. е. зерно низкой влажности, с которым случаются те же проблемы, что и с рожью.

Какое бы зерно вы ни выбрали, удостоверьтесь в следующем:

1. Субстрат полностью стерилизован перед добавлением перекиси.

2. Удалены все следы субстрата (питательной среды) с внешней поверхности контейнера.

Безусловно, проблема тщательной стерилизации существует и в случае приготовления субстрата в среде с фильтрованной атмосферой. Если споры плесени или бактерии находятся внутри зерен (в сердцевине) или в других частицах, составляющих субстрат, и они не были уничтожены путем автоклавирования или обработки в скороварке, то они могут прорасти и испортить субстрат вне зависимости от наличия фильтрованной атмосферы или добавленной перекиси. Неполная стерилизация означает также, что в зерне остается некоторое количество перекисеразрушающих ферментов, что приводит к появлению в субстрате областей, не защищенных перекисью.

Вторая проблема существует и в обычной практике культивирования. Если следы питательной среды попадают на внешнюю поверхность контейнера, это место впоследствии может стать центром заражения и распространения спор. Если такое случается с субстратом, который защищен перекисью, то культура может оставаться чистой до тех пор, пока не произведено ее перетряхивание для распределения мицелия. Но через несколько дней заражение станет более чем явным, т. к. микроорганизмы воспользуются недостатком перекисной защиты в новых многочисленных местах роста мицелия. Эту проблему можно предотвратить, тщательно очищая контейнеры изнутри и снаружи перед использованием и протирая внешнюю поверхность контейнеров спиртом после проведения инокуляции субстрата.

Вот как я делаю субстрат из мягкой белой пшеницы.

1. Помещаю 200 мл зерна в 800 гр банку.

2. Добавляю с избытком горячую воду из-под крана плюс небольшое количество питьевой соды, чтобы скорректировать кислотность воды.

3. Замачиваю зерно при температуре, близкой к кипению воды, в течение часа или двух, чтобы насытить водой сердцевину зерна, когда зерно увеличится в объеме примерно вдвое, я сливаю лишнюю воду.

4. В заключение, я стерилизую банку в зерном в скороварке в течение часа. Точное время стерилизации зависит от зерна и скороварки.

5. После охлаждения банки я добавляю 10 мл 3 % перекиси (или 20 мл перекиси на каждые 0.5 л первоначально взятого зерна), а затем хорошо перетряхиваю банку, чтобы перекись покрыла зерна.

Один грибовод добавляет к перекиси краситель, чтобы знать, когда перекись тщательно распределится по зерну. Если зерно заметно слипается, то достичь полного покрытия зерен будет непросто. В этом случае вам придется подобрать количество воды и не замачивать зерно в течение слишком долгого времени.

Окончательная концентрация перекиси является высокой, примерно 0.15 %, но грибной мицелий при этом растет хорошо, может быть только немного медленнее, чем без добавления перекиси (если вы готовите субстрат, добавляя отмеренное количество воды, то для достижения правильной влажности содержимого не забывайте вычитать из количества добавляемой воды объем перекиси).

В принципе, вы можете добавлять и меньшее количество перекиси, но если вы добавите меньше, чем 20 мл 3 % раствора на каждые 0.5 л зерна, вам скорее всего, придется перед добавлением разбавить перекись в большем объеме стерильной воды, чтобы обеспечить надежное покрытие зерна этим раствором. С другой стороны, в большинстве случаев вы можете добавлять до 40 мл перекиси без серьезного влияния на рост мицелия.

Контейнеры для субстрата

Я выращиваю мицелий в 800 г банках из-под соуса, потому что мне легче их достать. У этих банок крышки заворачиваются по резьбе. Литровые банки для консервирования тоже подойдут, особенно если у них есть резьбовые крышки, но крышки с внешним фиксатором тоже подойдут, если вы поместите внутрь их картонный диск несколько большего, чем надо, размера, чтобы обеспечить нужную высоту крышки для правильной фиксации.

Обязательно проверьте внутреннюю поверхность крышки на чистоту перед каждым использованием (это относится и к резьбе на банке). Следы старого субстрата на горле банки или внутри крышки могут вызвать большие проблемы. Пятна ржавчины на внутренней стороне крышек также могут удерживать частицы субстрата и обеспечивать условия для роста микробов.

Замечу, что добавление перекиси делает необязательным установку на крышках микропористых фильтров, как этого требуют традиционные методы. Тем не менее, крышки на банках являются уязвимым местом, даже при добавлении к среде перекиси, потому что вам придется перетряхивать банки для распределения мицелия, а при перетряхивании споры, которые диффундировали на внутреннюю поверхность крышки из воздуха (или фрагменты плесени, которые выросли в микроуглублениях на плохо отмытой крышке) могут войти в контакт с мицелием, который сам по себе не защищен. Чтобы исправить этот недостаток, присущий крышкам, я делаю следующее:

1. Приготовляю набор тонких картонных дисков, вырезанных по внутреннему размеру крышек (хорошо подходит картон от какой-нибудь коробки; просто очертите крышку на картоне при помощи ручки, а затем вырежьте по внутренней стороне круга, слегка к центру от линии).

2. В случае с субстратом-«десятиминуткой», я смешиваю ингредиенты, используя отдельную крышку, а затем, перед обработкой паром, устанавливаю крышки с картонными дисками на место.

3. После охлаждения субстрата я открываю крышки и смешиваю картонные диски 3 % раствором перекиси, наливая его в крышки слоем в 1–2 мм. Увлажненные перекисью крышки формируют затем барьер для источников заражения, находящихся в воздухе.

В случае с зерном или другим субстратом, требующим стерилизации, я заворачиваю крышки с картонными дисками в алюминиевую фольгу и стерилизую их отдельно от банок с субстратом, которые на время стерилизации закрыты отдельными крышками. Затем, после добавления перекиси в стерилизованный субстрат и распределения путем перетряхивания, я снимаю временные крышки и устанавливаю на место стерильные крышки с картонными дисками. После этого, я увлажняю диски 3 % раствором перекиси.

Инокуляция субстрата

Стерильные контейнеры с субстратом могут быть инокулированы двумя способами. Вы можете вырезать кусочки мицелия из агаровой культуры с помощью стерильного скальпеля и бросить их в контейнеры (Если вы изберете этот метод, то сперва встряхните банку или пакет, чтобы субстрат пересыпался на одну сторону. Таким образом вы можете поместить кусочек мицелия вглубь субстрата, но он при этом окажется у стенки контейнера и за ним можно будет наблюдать). Или вы можете перетрясти контейнер после добавления мицелия. Я предпочитаю не перетряхивать контейнер — это часто заканчивается тем, что кусочки агара прилипают к стенке в месте над субстратом. Это место не защищено перекисью, а стряхнуть агар посредством дальнейшего встряхивания банки затруднительно. К тому же, перетряхивание субстрата с перекисью не дает очевидных преимуществ. Небольшие фрагменты мицелия, которые отделяются при перетряхивании, вероятно, слишком малы для того, чтобы эффективно адаптироваться и продолжить свой рост в присутствии перекиси, концентрация которого при использовании в посевном субстрате достаточно велика. Поэтому я бросаю кусочки агара (для медленно растущих штаммов — по три кусочка) вглубь субстрата и закрываю контейнер. В случае с опилочным субстратом для Н. erinaceus я дополнительно уплотняю субстрат, постукивая банкой о стол, чтобы субстрат охватил кусочки агара, потому что этот вид, похоже, предпочитает субстрат плотной, утрясенной консистенции.