Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Если у вас нет ни агара, ни желатина, ни крахмала — культивируйте на плотиках из фильтровальной бумаги. Когда мы проводили работы по селекции каллусов на среде с ПЭГ (очень сильный осмотик, имитирующий засуху в этих экспериментах), то столкнулись с проблемой — агар в присутствии высоких концентраций полиэтиленгликоля не застывал после автоклавирования. Выход был найден — на дно пробирок или баночек клали комочек ваты (рыхлый), сверху — вырезанный по диаметру сосуда кусочек фильтровальной бумаги, заливали жидкой питательной средой так, чтобы ее уровень не превышал 1 мм над поверхностью бумаги. Высота столбика среды в пробирке диаметром 2 см — примерно 1–1,5 см, в баночке из под детского питания — 0,5 см.

В качестве мерной посуды можно использовать то, что продается в хозяйственных магазинах для домовитых хозяек — мерные стаканы. Для более мелких доз — в аптеке вы найдете шприцы в ассортименте, которые прекрасно заменят вам мерные пробирки и пипетки. Ультрафиолетовые лампы сейчас можно купить в хозяйственном магазине. Там же вы найдете хлорный отбеливатель для стерилизации экспланта. Сухожаровой шкаф с успехом заменит обычная духовка газовой или электрической плиты.

Правила стерильной работы в лаборатории

Выращивание изолированных клеток, тканей, органов, растений-регенерантов, водных культур и грибов, используемых в биотехнологии, проводят в условиях полной асептики, т. е. стерильно. Особое внимание следует обратить на чистоту посуды, предназначенной для приготовления питательных сред и их компонентов; на подготовку объектов к пересадке, пассированию и культивированию. Только некоторые объекты (хлорелла, азолла) можно выращивать в нестерильных условиях.

Приемы и методы стерилизации

Стерилизация — полное уничтожение микроорганизмов и их покоящихся форм (например, спор). Существуют разные методы стерилизации: с помощью влажного пара, сухого пара, облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.

Обработка влажным паром производится в автоклавах. Вегетативные клетки бактерий и грибов гибнут через 5-10 минут уже при температуре около 60 °C; для гибели спор дрожжей и грибов требуется температура 120 °C в течение 15 минут. Продолжительность автоклавирования зависит от величины (теплоемкости) пробирок, колб и объема питательной среды в них. Иногда автоклавируют несколько раз — дробная стерилизация. Этот прием используют для стерилизации, как питательных сред, так и посуды.

Стерилизация посуды.

Большинство культур в лабораторных условиях выращивают в пробирках, колбах Эрленмейера различного объема и чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика^[80]). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:

1. Посуду выдерживают в автоклаве под давлением в течение 20–40 минут при температуре 100–130 °C. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы — 20–40 минут, при 1 атм. — 15 минут.

2. При сухом способе стерилизации чашки Петри, колбы, стаканы, завернутые в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140 °C в течение 2 часов, при температуре 180 °C — 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.

Стерилизация инструментов.

Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т. д.) стерилизуют в сушильном шкафу способом № 2. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают.

Стерилизация материалов.

Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25–30 мин.

Стерилизация питательных сред.

Автоклавирование питательных сред для выращивания культур тканей проводят после их разлива в пробирки или колбы под давлением 0.7–0.8 атм. при температуре 115–120 °C в течение 15–30 минут, в зависимости от объема среды. Если в результате стерилизации среда помутнела, следовательно, неправильно выбран режим стерилизации^[81].

Холодная стерилизация.

Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм.

Как изготовить микробиологическую пробку

Для предотвращения заражения культур из воздуха и их преждевременного высыхания пробирки и колбы закрывают пробками. Пробки для посуды условно можно разделить на ватные (традиционные микробиологические) и крышечки из фольги.

С ватными пробками проще работать начинающим — меньше риска получить ожог. Пробки должны плотно входить в пробирку (колбу) на 2–3 см, или на 2/3 своей длины; при открывании хорошо закрытой посуды раздается характерный хлопок.

Недостатки микробиологических пробок — довольно трудоемки в изготовлении, часто прожигаются, не очень удобны при долговременном культивировании. Если для микробиологических культур сроки культивирования редко превышают 2 недели, то для растительных клеток продолжительность субкультивирования — как минимум 3 недели. За это время среда начинает подсыхать. Поэтому в таких случаях важно закрывать ватную пробку сверху герметично парафильмом или пищевой пленкой.

Крышечка из фольги проще в работе — легко изготавливается (вырезается кружочек или квадратик по диаметру горлышка пробирки или колбы + один — полтора сантиметра для отгибания вниз).

Фольгу нужно брать плотную. Если нет плотной — тонкая фольга складывается в 3–4 раза. При обжигании краешков такой пробки нужно быть аккуратным, чтобы не получить ожог, так как фольга металлическая и хорошо проводит тепло. После одевания пробки самый краешек, загнутый вниз на пробирку или колбу, оборачивается узенькой полоской парафильма или пищевой пленки в 2–3 оборота, таким образом краешки плотно прилегают к посуде, и крышка держится надежнее, герметичнее закрывает, снижается риск контаминации (занесения посторонней микрофлоры)