Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1
Шрифт:
Пиридоксин-НСl • 100
Тиамин-НС1 • 1000
— Добавлять в виде порошка в среду перед варкой:
Сахароза • 30 г/л
Агар-агар • 7 г/л pH
готовой среды • 5.5
Питательные среды для микроорганизмов и их приготовление[84]
1. Приготовление бобового агара
В 1 литре воды кипятят 100 г белой фасоли или белых бобов до готовности, избегая растрескивания бобов и превращения крахмала в клейстер. Отвар фильтруют в горячем виде и добавляют 2 % агара. Стерилизуют в автоклаве как обычно.
2. Приготовление среды для хлореллы
В качестве среды для культивирования зеленых водорослей
Са (NO3)2 — 0.25
MgSO4*7H2O — 0.06
КН2РO4 — 0.06
КСl — 0.08
Fе2Сl6 — одна капля 1 % раствора (можно заменить раствором хелатного железа из среды МС, 50 мл маточного раствора).
На растворе Кнопа можно также выращивать и ряску.
3. Приготовление среды для цианобактерий
Для культивирования цианобактерий рекомендуется среда Чу N 10 (г/литр раствора):
Са(NO3)2 — 0.04
MgSO4*7H2O — 0.025
KH2PO4 — 0.01
Na2CO3 — 0.02
Na2SiO3*9H20–0.025
FeCl3*6H2O — 0.0008 (также можно заменить хелатом железа)
4. Приготовление питательного агара для грибов (агар Чапека)
Состав среды Чапека (г/литр раствора):
Сахароза — 30 г
NaNO3 — 3 г
КН2РO4 — 1 г
MgSO4*7H2O — 0.5 г
КСl — 0.5 г
FeSO4*7H2O — 0.01 г
Агар-агар — 15 г
На дно колбы насыпать агар (можно брать пол-литровые обычные бутылки, тогда на 1 литр среды необходимы 3 бутылки, в каждую их которых насыпать 1/3 агара, т. е. 5 грамм) и залить раствором солей. Колбу или бутылки поставить в автоклав на стерилизацию на 20 минут. После стерилизации, покачивая колбу, тщательно перемешать содержимое, иначе агар останется на дне, и застынет только нижний слой среды.
В боксе среду разлить по стерильным чашкам Петри или пробиркам. Проверить на бактериальное заражение, выдержав 3–4 дня при комнатной температуре. В дальнейшем лучше хранить в холодильнике, так как там среда меньше испаряется.
5. Среда Прата для хранения коллекции культур водорослей
Длительно выдерживать зеленые водоросли без пересева не рекомендуется, так как водоросли могут прекратить свой рост в результате самоотравления продуктами жизнедеятельности. Признаками такого угнетения могут служить пожелтение культуры, появление белесого оттенка на среде и ее помутнение. Сохранить коллекцию водорослей можно на твердых питательных средах, где рост культуры замедлен, поэтому частые пересевы не требуются (раз в месяц, а если хранить при слабом рассеянном свете при температуре 10–15 °C, то и раз в два месяца). Состав среды Прата (г/литр раствора):
KNO3 — 0.10
MgSO4*7H2O — 0.01
К2НРO4 — 0.01
FeCl3*6H2O — 0.001
агар-агар — 12 г
Среду простерилизовать.
Методики культивирования клеток
Начнем с того, что растительные и животные клетки предъявляют совершенно различные требования к условиям культивирования.
Для животных клеток диапазон оптимального существования очень узок. Это касается и температурных условий, и состава питательных сред (необходимо строго выдерживать pH, молярность и т. д.), и газового состава. Пожалуй, наименее требовательны они к освещению. Для выращивания животных клеток всегда используют готовые фабричные питательные среды, а для длительного поддержания линии нужен термостат. Для некоторых видов клеток газовый состав воздуха можно обеспечить, поместив флаконы с культурой в эксикатор (емкость с притирающейся крышкой) в который также помещают горящую свечку. Когда эксикатор плотно закрыт, свеча затухает сама при концентрации углекислого газа в воздухе 5 %.
Подробнее о условиях культивирования животных клеток и культивировании органов можно прочесть в учебнике по биотехнологии.
Заводить и вести культуру растительных клеток гораздо проще. Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27 °C, в темноте или при освещении. Среды для них — несложные, и их легко приготовить самому. Культивировать можно на твердых питательных средах с добавлением агар-агара, крахмала (методика изложена в главе "питательные среды" или на жидких питательных средах, с использованием мостиков из ваты и фильтровальной бумаги.
Суспензионные культуры растительных клеток поддерживать гораздо сложнее — необходима мешалка для постоянного перемешивания среды. Иначе эксплант погиб нет, в первую очередь, от отсутствия доступа кислорода.
Условия освещения различны в зависимости от поставленных вами задач. Каллусную ткань обычно получают в темноте. Клональное микроразмножение проводят при освещении. В качестве источника света лучше пригодны лампы дневного света. Они не нагревают камеру и имеют более или менее подходящий для растений спектральный состав света.
ПОЛУЧЕНИЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ У РАЗНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ
Каллус — определенным образом организованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллусной ткани контролируется фитогормонами типа ауксинов и цитокининов. Под действием ауксинов происходит дедифференцировка, а под влиянием цитокининов — интенсивное деление, в результате которого образуется ткань.
Спонтанное образование каллусной ткани в природе мы можем наблюдать на месте повреждения. Каллусные клетки затягивают рану, а впоследствии дифференцируются в утраченные ткани растения. Например, когда вы черенкуете розы или другие древесные растения, то на месте нижнего среза, погруженного в воду вырастает мозолеобразое образование — каллус, из которого затем формируются корни, происходит укоренение черенка. Очень часто каллус формируется на поврежденных корнеплодах моркови (особенно в месте среза листьев), на черешках кочанов капусты.
Каллусную ткань также можно получить на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, используя фрагменты самых разных частей растения: стеблей, корней, тканей клубня, листьев, зародышей, семядолей и т. д. Такие фрагменты называются эксплантами.
Получение каллусной ткани из листьев табака
Табак — классический объект для получения каллусной ткани и дальнейших ее исследований. Клетки табака легко дедифференцируются и переходят к делению, образуя быстро растущую каллусную ткань. Кроме того, в каллусной ткани табака легко вызвать регенерацию.