Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1

Продолжительность стерилизации меристем сулемой — 5 минут, семян — 15–20 минут, пергидролем соответственно 15 и 30 минут.

После стерилизации материал переносят в стерильную дистиллированную воду, выдерживают 10 минут, затем меняют воду ещё два раза, выдерживая в каждой порции по 15–20 минут. В стерильных чашках Петри или на стерильных листах бумаги, или на обожженной кафельной плитке обрезают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала, где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для образования каллусов. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафинировать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может привести к интоксикации ткани.

Ход работы

Простерилизовать инструменты, посуду и питательные среды, необходимые для проведения работ по выращиванию стерильных проростков и выращивания каллусных тканей.

1. Завернуть в плотную бумагу и простерилизовать сухим жаром в сушильном шкафу стеклянную посуду — колбы, чашки Петри.

2. Подвергнуть предварительной стерилизации в сушильном шкафу скальпели и пинцеты. Перед помещением в сушильный шкаф завернуть инструменты в плотную бумагу.

3. Простерилизовать в автоклаве дистиллированную воду в колбе. Для получения стерильной воды налейте в колбу 1/3 часть объема дистиллированной воды, закройте ватной пробкой, а сверху плотной бумагой или целлофаном, можно обернуть горлышко фольгой. Автоклавировать 30 минут при 1 атмосфере.

4. Простерилизовать в автоклаве в течение 20 мин при давлении 1 атм. пробирки с питательной средой, закрытые фольгой или ватными пробками, обернутыми плотной бумагой или целлофаном.

Питательные среды для растительных биотехнологических объектов

Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, Р, К, Са, S, Mg, Fe, В, Zn, Сu, Со, Mn, J, Мо); витамины B₁, В₆, В₁₂, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей.

На средах без гормонов растут "привыкшие" и опухолевые ткани.

Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов.

Из ауксинов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) — 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) — 0.1–2 мг/л, ИУК — 1-30 мг/л.

Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов.

В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (ЕАП), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др.

Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания:

— среда без глюкозы — для хлореллы, цианобактерий;

— среда без витаминов и гормонов — для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna);

— среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами — для культивирования клеток и тканей высших растений.

Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В₅), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Составы питательных сред, получивших наибольшее распространение, приведены в справочниках по физиологии растений и биотехнологии. Ниже вы найдете прописи для базовых сред для культивирования растительных клеток: среда Мурасиге-Скуга и среда Гамборга, некоторые микробиологические среды.

Состав питательных сред для растительных клеток

Среда Мурасиге-Скуга

Компоненты • Концентрация солей в 1 литре готового маточного раствора, мг • Объем маточного р-ра, мл для приготовления 1 литра среды

— маточный раствор макроэлементов

NH₄NO₃ • 33000 • 50

KNO₃ • 38000

СаСl₂*2Н₂O • 8800

MgSO₄*7H₂O • 7400

КН₂РO₄ • 3400

— маточный раствор микроэлементов

KJ • 166 • 5

Н₃ВО₃ • 1240

MnSO₄*H₂O • 4460

ZnSO₄*7H₂O • 1720

Na₂MoO₄*2H₂O • 50

CuSO₄*5H₂O • 5

СоСl₂*6Н₂O • 5

— маточный раствор хелатного железа

FeSO₄*7H₂O • 5560 • 5

Nа₂ЭДТА*2Н₂O 7460

— витамины и органические вещества

Мезоинозит • 20000 • 5

Никотиновая кислота • 100

Пиридоксин-НСl • 100

Тиамин-НСl • 100

Глицин • 400

— Добавлять в виде порошка в среду перед варкой:

Сахароза • 30 г/л

Агар-агар • 7 г/л pH

готовой среды • 5.6–5.8

_{* для получения стерильных проростков на 1 литр среды берут 1/2 часть маточных растворов, т. е. вместо 50 мл раствора макроэлементов берут 25 мл и т. д.}

Среда Гамборга (В₅)

Компоненты • Концентрация солей в 1 литре готового маточного раствора, мг • Объем маточного р-ра, мл для приготовления 1 литра среды

— маточный раствор макроэлементов

(NH₄)₂SO₄ • 2680 • 50

KNO₃ • 50000

СаСl₂*2Н₂O • 3000

MgSO₄*7H₂O • 5000

NaH₂PO₄*H₂O • 3000

— маточный раствор микроэлементов

KJ • 75 • 10

Н₃ВО₃ • 3300

MnSO₄*H₂O • 1000

ZnSO₄*7H₂O • 200

Na₂MoO₄*2H₂O • 25

CuSO₄*5H₂O • 25

СоСl₂*6Н₂O • 2.5

— маточный раствор хелатного железа

FeSO₄*7H₂O • 5560 • 5

Nа₂ЭДТА*2Н₂O • 7460

— витамины и органические вещества

Мезоинозит • 10000 • 10

Никотиновая кислота • 100