Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1
Шрифт:
— источник углерода: глюкоза — 40 г/л
— агар-агар 7 г/л
— гормоны: гиббереллин — 0.1 мг/л, 6-ЕАП — 2 мг/л
— pH готовой среды 5.6–5.8).
Ход работы
В качестве экспланта используют боковые почки из средней части 1-летнего побега. Побеги промывают водопроводной водой с мылом, ополаскивают дистиллированной водой, вырезают почку. Стерилизуют сначала 70 % этанолом в течение 1 минуты, а затем в растворе хлорамина 10 минут. Трижды промывают стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут). Срезы обновляют, снимают почечные чешуи и переносят почки на агаризованную питательную среду в пробирки. В некоторых случаях экспланты переносят на свежую питательную среду, так как в среду выделяются полифенолы. Культивируют
Перенос посадочного материала в почву
Материалы и оборудование
Пробирки с растениями, горшки с почвой; почву желательно прогреть или проавтоклавировать до посадки растений.
Ход работы
Сделать пробиркой углубление в увлажненной почве в горшке. Пробирочное растение вынуть из пробирки, поместить в горшки с почвой, не отмывая агаровой среды. Уплотнить почву вокруг растения. Первые 3–5 дней желательно прикрывать растения стеклянным колпаком. Через 10 дней растения пересаживают на постоянное место в теплице.
ПОДДЕРЖАНИЕ И СОХРАНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР
Поддержание и сохранение культуры картофеля
Материалы и оборудование
Пробирки с растениями картофеля, стерильный пинцет, скальпель, кисточка, стаканчик с этанолом, чашка Петри, кафельная плитка, спиртовка, спички, пробирки с питательной средой МС.
Для замедления роста растений из черенков ТУР (ретардант, применяемый в сельском хозяйстве против полегания стеблей растений — хлорхолинхлорид, ССС) в концентрации 0.4–0.5 мл/л добавляют в среду МС, при этом промежуток между двумя последующими черенкованиями увеличивается с 1 до 4 месяцев, а высота со сближенными междоузлиями не превышает 3–4 см. Растения приобретают темно-зеленую окраску.
Одним из способов сохранения и поддержания коллекции in vitro является клубнеобразование в пробирках. На процесс образования клубней in vitro оказывает влияние фотопериод, температура, ростовые вещества, содержание сахарозы в питательной среде.
Ход работы
Черенки переносят на модицифированную питательную среду МС для образования клубней картофеля, ее компоненты:
Макроэлементы по прописи МС
Микроэлементы по прописи МС
Источники железа
Витамины по прописи МС + аденин — 0.25 мг/л
Источник углерода: сахароза — 70 г/л
Агар-агар — 7 г/л
Гормоны: ИУК — 1 мг/л
pH готовой среды — 5.6–5.8.
Культивирование черенков проводится под люминесцентными лампами при 10 часовом фотопериоде, освещенности 3.5–4 тыс. люкс, влажности 70 %. После трехнедельного выдерживания на 10-часовом фотопериоде растения переносят на 2 суток в темноту, а затем на 16 часовой период и оставляют в этих условиях до завершения клубнеобразования. После отмирания растений и достижения микроклубнями размера 0.7–1.4 см их извлекают из пробирок (в стерильных условиях) и хранят в пробирках, закрытых ватными пробками, в холодильнике, при температуре +2 — +4 °C.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК
Культивирование фибробластов человека
Культуральная посуда и оборудование
Пипетки мерные от 1 до 10 мл, пипетки Пастера, пенициллиновые флаконы, пробирки Лейтона, мерные флаконы от среды разных объемов, пробки резиновые № 10, 12.5, 14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно нарезанные для помещения
их в пенициллиновые флаконы, пинцеты глазные анатомические и хирургические, зажим Кохера, бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей стали, резиновая груша для работы с пипетками (с надетой резиновой трубкой), инвертированный микроскоп, ламинар-окс, термостат.Питательная среда
Фибробласты успешно культивируют на разных средах, но рекомендуется использовать следующий состав питательной среды — среда Игла — 90–85 %, сыворотка крупного рогатого скота — 5-10 %, пуповинная сыворотка человека (фетальная сыворотка) — 5 %, глютамин — 150 мг на 500 мл готовой среды. Готовую среду и её компоненты рекомендуется хранить при 4 °C. При культивировании эксплантов рекомендуется использовать антибиотики (40–60 мкг канамицина на 1 литр среды).
Ход работы
1. Взятие биопсии. Фибробласты можно получать из многих тканей и органов. Проще всего — фибробласты дермального слоя кожи. Наиболее удобно брать биопсию со внутренней стороны предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфицируют 70 % этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять другие дезинфицирующие растворы, так как в случае проникновения в биопат они могут оказать токсическое действие. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают и отрезают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета. Не следует стремиться взять глубокие слои кожи. При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой кожи, кровотечение минимально. Отсечение лучше проводить лезвием безопасной бритвы, простерилизованной (как и пинцет) путем погружения в этиловый спирт с последующим поджиганием. Отсеченный кусочек погружается в заранее приготовленный пенициллиновый флакон со средой. На рану накладывают бактерицидный пластырь. Фрагмент кожи может храниться в питательной среде при 4 °C в течение 3–4 суток без утраты фибробластами способности к росту.
2. Получение экспланта. В стерильную чашку Петри с каплей 0.25 % раствора трипсина или питательной среды помещают фрагмент кожи. Придерживая пинцетом, нарезают на мелкие кусочки величиной с булавочную головку и меньше стерильным лезвием безопасной бритвы, зажатой в зажим Кохера или Пеана. При помощи изогнутой препаровальной иглы кусочки извлекают из капли и помещают на покровное стекло, находящееся в пенициллиновом флаконе или пробирке Лейтона. Уложенные кусочки накрывают другим покровным стеклом, слегка прижимая препаровальной иглой. Наливают в культуральный сосуд питательную среду так, чтобы она покрыла верхнее стекло. Покровные стекла с зажатыми между ними кусочками кожи при помощи пинцета кладут на боковую стенку пенициллинового флакона. Флаконы плотно закрывают пробкой и устанавливают на подставке под углом примерно в 30°. Культуры инкубируют в термостате при 37 °C. В течение недели следят за цветом среды. Изменение цвета индикатора к желто-оранжевому свидетельствует о хорошем состоянии экспланта.
Через неделю ежедневно начинают просматривать культуру под микроскопом. Можно использовать как инвертированный, так и обычный микроскоп. В последнем случае следует осторожно повернуть флакон, при этом стекла с культурой прилипают к боковой стенке флакона и могут быть исследованы при малом увеличении. Вокруг кусочков вначале появляются единичные фибробласты, которые заметны в виде длинных веретеновидных клеток, либо появляется слой эпителия, окружающий фрагмент в виде "кружевного" ореола. При появлении зоны выроста клеток следует сменить среду. Когда клетки займут все пространство между кусочками (это видно невооруженным глазом или при помощи лупы), их пересевают.
Пересев фибробластов человека
Материалы и оборудование
Флаконы с питательной средой, трипсин, покровные стекла, пипетки, препаровальные иглы.
Пересевы производят для получения количества клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического исследования, а также для криоконсервации. Клеточный штамм считают установившимся, если после пассирования в течение первых 5 пассажей прирост клеток спустя 3–4 суток после пересева превосходит количество посеянных минимум вдвое, что позволяет пересевать такие клетки в отношении 1:2 (из одного сосуда в два).